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绳状青霉耐酸分子机制研究

  • 发布日期:2015-01-23
  • 责任编辑:lgg
  • 论文字数:36200
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  • 论文编号:fb201501211056079682
  • 论文类型:硕士毕业论文
  • 论文价格:150

1前言


1.1极端微生物的研究概况
过去几十年的研究使我们认识到,地球上凡是有水的地方就有生命的存在。(?然界中,在各种极端环境下均发现有生物体存活。极端环境包括物理极限(例如温度、压力、辐射)和地球化学极限(如pH、盐度和氧气等)(Rothschild and Mancinelli, 2001 )。生存在极端环境下的生物称为极端微生物。Kristjansson和Hreggvidsson(1995)对极端微生物的描述为:生活在正常环境之外的生物体。iH常环境指的是温度在4?4(rC,pH值在5?8.5,盐度介于淡水和海水之间等。极端微生物包括嗜热微生物(生长在高温环境中)、冷适应微生物(生长在低温环境中)、嗜酸微生物(生长在低pH环境中)、嗜碱微生物(生长在高pH环境中)、嗜压微生物(生长在极端压力环境中)、旱生生物(生长在干燥环境中)和嗜盐生物(生长在高盐环境中)(Rothschild and Mancinelli, 2001; Magan,2007)o在生命三域中(古生菌、细菌和真核生物)均发现有极端微生物(Rothschild andMancinelli, 2001; Magan, 2007; Seckbach and Oren,2007)。多数极端微生物属于古生菌和细菌,尤其是古生菌。在极端环境下的真核生物一般为真菌和藻类。极端微生物在许多生态系统具有重要的作用,并且可以为人类提供丰富的微生物资源。极端微生物的研究不仅为我们提供了应对现代生物学范式的创新性发现,并促使我们重新思考一些有趣的问题。各种微生物适应极端环境的机制为研究大多数物种在其生物进程中的基本特征提供了独特的视角。极端微生物对于有关原始生命进化学的研究也是至关重要的。另外,极端微生物独特的形态结构、分子进化机制、特殊的生理生化机制及特殊的代谢产物在工业进程中的各种应用也为生物技术的发展开创了一个新纪元。
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1. 2丝状真菌遗传转化研究综述
丝状真菌作为低等的真核生物具存独特的形态学、生理学特征,在生物圈物质循环和生态系统中扮演重要伯色,在工业、农业、医药以及驻础生物学研究发挥范1K要作用,对人类生命活动的各个方面有着深远的影响。它既是能引起各种真菌病谨的病原菌(如炭疽菌、稻瘟菌等)也足病害生物防治(如绿僵菌、木霉菌等)的重要乎段。丝状真菌中的构巢曲霉和粗糖脉孢霉是生物学越础研究的模式菌株。随着越来越多的真菌全基因组测序成功,真菌生物学研究进入了功能基因组时代(Caroline, 2005),对能够进行大规模功能基因组研究工具的需求明显增加。构建突变体库是研究功能基因的重要方法,这一方法的关键因素在于遗传转化系统的研究和发展(黄亚丽等,2007)。遗传转化技术的发展对于人们进一步分离基因和分析基因的功能提供了强有力的工具。真菌的遗传转化包括两个方面:一是将遗传因子转化到受体细胞中;二是分离获得外源遗传因子的受体细胞(李娟等,2006;杨长得等,2006)。
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2材料和方法


2.1材料
2.1.1供试菌和转化质粒
供试菌株:绳状青霉X33 (.Penicillium.funiculosum)山山东农业大学分子植物病理实验室分离保存;大肠杆菌co//) DH5a,本实验室购买并保存;根癌农杆菌tumefaciens LBA440)和质粒110101-11丫£1"0、pROKlI-GFP由本实验室构建并保存;质粒pUCATPH (含潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph)由中国农业大学彭友良教授惠赠。质粒p3SR2由本实验室购买并保存。毕赤酵母GS115和酵母穿梭载体PPIC3.5K购自Invitrogen公司。
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2.1.2抗生素和试剂
乙酷丁香酮(简称AS)、2-(N-马啉)乙礎酸(简称MES)、头抱霉素,羧节青霉素,卡钠霉素购自 Sigma 公司;DNA Marker、High Pure dNTPs、EasyTaq DNA Polymerase购北京全式金公司;E.Z.N.A Gel Extraction Kit购OMEGA公司;普通质粒小提试剂盒购根公司;T4 DNA连接酶、限制性内切海及其它工具酶购自Fermentas公司;潮霉素 B,DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 购Roche 公司 ;溶壁酶(Lywallzyme,简称为L)(广东街微生物研究所),其它化学试剂均为国产分析。
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2.2菌株的鉴定


2.2.1菌落形态观察及生长pH测定
绳状青霉X33最初分离自中国的食醋,其pH低至2.2。PDA培养基作为分离培养基。绳状青霉X33的鉴定依据为形态学特征和ITS序列。将该菌接种在PDA平板上,在28°C的培养箱中培养,观察生长情况,并在显微镜下观察孢子形态。为了测定绳状青霉X33的生长pH范围,将其接种在pHO.5到13.0的PDA培养基上,28°C培养若干天之后拍照。PDA培养基pH用H2SO4和NaOH来调节,H2SO4和NaOH在倒PDA平板之前加入到化好的培养基中,加入的量根据pH计的测定。
………


3结果与分析 ..........55
3.1  Penicillium. funiculosum X33 的鉴定......... 55
3.2农杆菌介导的绳状青霉X33的遗传转化.........57
3.3绳状青霉X33耐酸相关基因的克隆及分析......... 65
4 讨论 .........103
5结论与建议......... 1075
5.1 结论......... 107
5.2 建议......... 108


4讨论


绳状青霉X33广泛分布,除了极冷的地区,大部分地区和气候都有此菌的分布。该菌的最适生长温度是25-28°C,最低生长温度为17-19°C, 5°C不生长,最高为41-42°C(Domsch et al., 1980),其耐酸菌株分离自 pH3.0?3.7 的环境(Gross and Robbins 2000)。绳状青霉X33分离自中国的一种食醋,该食醋的pH为2.4。历史上,食醋起源于中国。醋,古汉字为“酢”,又作“醯”。3000年前的《周礼》有“醯人掌共醯物”的记载,可以确认,我国食醋西周已有。食醋作为古代中国的杰出发明之一,至少有3000年的历史。在这么漫长的一段时间里,绳状青霉X33可能是通过突变和自然选择来适应这种极酸的环境,并且通过产生一系列的孢子生存来渡过不良环境。为了在极端酸性环境下生存,绳状青霉X33在其进化过程中可能会面临更高的酸性环境,或者从绳状青霉X33碱性菌株进化而来。令我们感到有意思的是,是什么机制使得绳状青霉X33在这种极度的酸性环境下生存。对能在pHO的条件下生长的嗜热嗜酸古细菌Picrophilus torridm基因组的序列分析和注释,使我们进一步了解了那些能在如此极端酸性的环境中生存的生命。该古细菌基因组有超过10%的序列编码次级转运蛋白(Futterer et al, 2004)。众多由质子驱动的次级转运体可能代表这些生物体适应极端酸性环境的一种策略(Futterer et al.,2004; Grossmanet al, 2004)。已经有文章详尽的描述了参与大肠杆菌的酸耐受系统的APC家族的两个次级转运体 Adic 和 GadC(Richard and Foster 2004; Foster 2004; Ma et al., 2012; Gao et al.,2009; Gao e。本研究中,我们首次从绳状青霉X33屮克隆得到一个主要协助转运蛋白超家族(MFS)成员P/MES并进行了功能分析。我们证明了 PyMES参与了绳状青霉X33的耐酸性和细胞内pH平衡。这是首次报道关于主要协助转运蛋白超家族运转体参与耐酸性和细胞内pH稳态。

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结论


本论文对绳状青霉X33耐酸的分子机制进行了研究。分离得到一株耐酸的绳状青霉X33,利用农杆菌介导的转化建立了该菌的遗传转化体系并进行了优化,构建了绳状青霉X33T-DNA插入突变体库,对不耐酸的突变子M4进行系统分析,取得如下结果:
1、从pH2.2食醋中分离得到一株能在pHO.6生长的丝状真菌。经ITS序列比对结合形态学分析,命名为绳状青霉X33。经测定,该青霉的生长pH范围为0.6-3.0,能在pHl.O活跃生长。
2、建立了农杆菌介导的绳状青霉X33转化系统并进行了优化,构建了 T-DNA插入突变体库。形成了高效的绳状青霉转化体系:IM培养基中AS浓度为400[iM,OD600为0.25培养6小时后的农杆菌菌液与浓度为106个/mL新鲜制备的孢子悬液等体积混合,400nL混合液涂布到含40(HiM AS铺有玻璃纸的共培养基上,28°C共培养48h。在该转化条件下农杆菌LBA4404对绳状青霉X33的转化效率为100?200个转化子/106个孢子。利用该转化系统筛选了 9300株转化子,突变库中的转化子遗传稳定性高、Southern杂交显示转化子基因组中T-DNA插入拷贝数为1-2个,其中87.7%为随机单拷贝插入。
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参考文献(略)

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